讲述蛋白质群落的故事

概览

我们非常荣幸地邀请到 Don Kirkpatrick 博士作为我们的首位演讲嘉宾。他其实是 BioRender 最早期的忠实拥护者，甚至曾邀请我们三位联合创始人中的两位——Shiz 和 Ryan——前往他在基因泰克（Genentech）工作期间所在的湾区举办研讨会。他从 BioRender 创立之初就给予了我们极大的信任，并在多年前为我们改进产品提供了大量宝贵建议，对此我们深表感谢。在背景方面，Kirkpatrick 博士研究蛋白质（特别是泛素）已超过 20 年。他的学术生涯涵盖生物化学和药理学，随后在哈佛医学院完成了博士后研究。之后，他将自己的经验带到了基因泰克，致力于开发用于药物研发的质谱蛋白质组学技术。目前，他担任 Interline Therapeutics 的副总裁兼首席技术官。今天，我们很高兴能听取 Kirkpatrick 博士关于蛋白质群落的演讲，以及他对于如何向不同科学背景的人群传达此类研究重要性的见解。请大家和我一起，以热烈的掌声欢迎 Don Kirkpatrick 博士。

好的，非常感谢您精彩的介绍。很高兴能来到这里，向大家讲述 Interline Therapeutics 的起源故事，以及蛋白质群落的故事。我也很高兴能与 BioRender 团队相聚。看着 Ryan、Shiz 和整个 BioRender 团队不断成长，开发出能帮助我们这些科研人员更好地讲述科学故事的工具，这真是一件令人欣慰的事。

今天我想讲的故事始于普通的人类细胞，这是一张扫描电子显微照片。

在人类巨噬细胞中，平均每个细胞包含 100 亿个蛋白质分子，这几乎相当于地球上人类的总数。有趣的是，细胞内蛋白质的浓度非常高，接近每毫升 100 毫克。如果做一个类比，这就好比你缩小到地球视角，俯瞰一个挤满人的体育场，每个人都在互相碰撞，其中有家庭、团体、同事等等。

当然，正如我们所知，就像人类社会一样，环境中存在各种力量，例如感染，这些力量会极大地改变群落的行为、活动、功能以及它们聚集和堆积的场所。蛋白质的情况也是如此。

正如我所说，平均每个细胞含有 100 亿个蛋白质，浓度极高，就像煎饼糖浆一样。大多数蛋白质在复杂的蛋白质群落中发挥作用；它们之间存在着许多我接下来要讲的关系。然而，尽管如此，药物研发在历史上一直倾向于孤立地研究单个蛋白质，且实验中的蛋白质浓度通常在每毫升 1 毫克左右，远低于细胞内近 100 毫克的浓度。此外，人们大多使用简单的单一终点读数来理解本应非常复杂的过程。因此，Interline 的前提之一是，通过理解蛋白质群落，我们可以提高药物研发的成功率，这也是我今天想向大家详细介绍的内容。

关于我个人的起源故事，以及我是如何开始思考蛋白质群落与药物研发之间联系的，这要从我在俄克拉荷马大学获得生物化学学士学位说起。我想说的是，和我们许多人一样，我们的科学职业生涯是由早期接触的导师塑造的。我的第一位导师是 Pete Smith 博士，我在毒理学学会上认识了他。他为我争取到了第一次实习机会，真正鼓励我去探索科学和药物研发，让我意识到那里有重要且有趣的发现等待挖掘。他曾就读于俄克拉荷马大学，并鼓励我加入那里的药理学系，在那里我遇到了对我职业发展起到关键作用的第二位科学导师——Jay Gandolfi 教授。Jay 给了我自由，让我真正开始探索和理解蛋白质。我开始关注这种我过去 20 年一直在思考的蛋白质。我认为它是所有人类细胞中最重要的蛋白质，那就是泛素。

我们很早就开始尝试使用一种新技术来研究蛋白质，那就是质谱仪。正是这项工作促使我前往哈佛医学院 Steve Gygi 的实验室进行博士后研究。我之所以这样做，很大程度上是因为我的一位老朋友兼同事 Jin Min Pang 发表的一篇论文，他当时是 Steve 实验室的博士后。他们鉴定出了 1072 种被泛素修饰的蛋白质，而我的博士论文中只有 23 种。当你看到这种在技术上如此先进、远超你想象的东西时，你就能明白，去学习这些正在兴起的新技术，并了解它们如何用于探索我们感兴趣的生物学问题，对我来说有多么重要。

后来我在 Steve 的实验室里完成了这项工作，专注于泛素及其控制的蛋白质群落。当时，我们并没有意识到它们本身就是群落。你知道，细胞周期中涉及的蛋白质（如细胞周期蛋白 D）或重要的药物靶点（如表皮生长因子受体 EGFR）的泛素化，促使我后来进入基因泰克工作。在那里，我再次花费多年时间试图阐明与人类疾病和药物研发相关的蛋白质群落。在那段时间里，我与发现蛋白质组学小组的一支优秀团队合作，继续构建技术来理解人类细胞、疾病中出错的过程，以及我们如何通过药物干预来帮助患者。

我在那里参与的第一个项目是研究一种名为 LRRK2 的蛋白质，这是一种与帕金森病相关的激酶。除了让我们了解到疾病相关变异如何改变细胞外功能外，这个项目还让我结识了稍后会向大家介绍的 Zack Sweeney，他现在担任 Interline Therapeutics 的首席执行官。最近，我们致力于利用质谱技术研究突变蛋白质，特别是驱动癌症的突变致癌蛋白。我们能够通过质谱仪证明，这些突变蛋白可以被药物选择性降解，从而对癌细胞的生存能力产生深远影响。

泛素是一种非常重要的蛋白质，控制着细胞内大量的不同过程。它发挥关键作用的地方之一是线粒体——细胞的动力工厂。线粒体内约有一千种蛋白质，除 13 种外，其余所有蛋白质都必须跨越线粒体膜输入，而泛素在其中再次发挥了关键作用。质谱分析帮助我们理解了参与该过程的许多关键蛋白质。

有一种被称为自噬的泛素样过程或途径，它在许多不同的细胞中发挥作用。它的功能之一是帮助细胞在感染病原体时进行自我管理。我们希望了解自噬途径和先天免疫信号传导在其中是如何运作的。

我提到这篇论文有几个原因。这是我第一次制作 BioRender 图表的论文，我们最终将其发表了。同时，这项技术也展示了蛋白质组空间的广阔性，以及我们能够以丰富的细节理解这些蛋白质功能的能力。

几分钟后我会详细谈谈这一点。最后，还有一些旨在探索动态蛋白质群落的技术工作，这也是我稍后会回到的故事。这项工作引起了包括 Zach Sweeney、Nick Galley、Onn Saha 以及在 Interline Therapeutics 聚集的团队的注意。他们的理念是，蛋白质群落确实可以成为药物研发的核心，我们可以部署相关技术来探索它们，并以一种真正有助于更有效、更高效、更成功地开发药物的方式来理解其功能。

那么，让我们多谈谈蛋白质群落。它们是什么？它们意味着什么？蛋白质组学在这种背景下如何帮助我们？让我们从蛋白质组开始。蛋白质组是细胞和组织内存在的所有蛋白质的完整组成。如果你回到那个人类巨噬细胞或任何其他单个细胞，大约有 10,000 到 11,000 个不同的基因在表达 10,000 到 11,000 种不同的蛋白质。其中一些蛋白质在每个细胞中存在一百万个或更多拷贝，而有些可能只有 1、10 或 100 个拷贝，总计构成了这 100 亿个蛋白质分子。人类细胞的蛋白质组反映了各种不同的输入：细胞的基因型、细胞类型（是人心肌细胞、肝细胞还是像巨噬细胞这样的免疫细胞）、细胞所处的环境（是否存在炎症、组织损伤或其他情况），当然还有扰动状态（是否接触过药物或其他有毒化学物质）。蛋白质组会在所有这些背景下进行自我重塑。

这就是蛋白质组，而蛋白质组学正是我们试图理解蛋白质组的棱镜。质谱仪和质谱分析是让我们有机会了解蛋白质及其功能和活动的众多工具之一。我们开始将这些视为蛋白质群落，即蛋白质群体之间的关系，这实际上是蛋白质组的维度或切片，通过它们你可以了解正在发生的事情。

在蛋白质群落中，我们将它们视为物理群落，即物理上相互接触的蛋白质。你可以想象家庭成员，例如。功能性蛋白质群落是指在单一过程中发挥作用的蛋白质。你可以想象你在工作中与之共事的同事。还有空间蛋白质群落。它们在物理或功能上没有关联，但恰好居住在同一个地方，也许就像住在同一栋公寓楼里的人。最后是共调节群落，这是一个稍微抽象一点的概念，你可以将其等同于拥有相同政治或宗教信仰的人，它们受到某种更高阶过程的驱动而发挥功能。

这就是我们看待蛋白质组和蛋白质群落的方式。Interline Therapeutics 的前提是，目前的方法还不足以让我们充分理解蛋白质群落内部的分子机制。这里涉及的范围非常广泛。

药物研发中使用了多种技术，例如成像、通过 RNA 测序表征 mRNA，以及通过代谢组学分析代谢物。然而，绝大多数药物靶点都是蛋白质。通过专注于这一层面，不仅要了解单个蛋白质，还要了解蛋白质在物理、功能和空间上所有复杂的相互作用，我们就有更好的机会理解疾病过程以及药物的作用方式。我们相信，蛋白质组学有望为经过基因验证的治疗靶点定义分子机制。

这张幻灯片展示了蛋白质复合物或更大的蛋白质群落如何在分子的成功或失败中发挥重要作用。有些靶点存在基因相关变异，它们参与的复合物，以及这些疾病领域中各个蛋白质的调节剂。我们的想法是，如果我们将蛋白质组学置于药物研发的核心，我们就可以从浅蓝色框扩展到深蓝色框，并将更多的治疗靶点纳入我们的行动范围。

我们认为，一流的药物是由其对蛋白质相互作用的影响来定义的。在生物技术和制药行业的各种成功和失败的药物研发项目中，情况越来越如此。大部分工作都是为了抑制酶或蛋白质的催化位点，这对于成功的药物来说大体上是有效的。但在不成功的情况下，原因有很多。例如，那些不是由催化作用、不是由酶的活性或功能驱动，而是由两个蛋白质相互作用驱动的过程，往往没有被考虑到。还有一种罕见的情况，这在癌症中重要的癌基因或蛋白质 Wrath 的背景下表现出来，即抑制这种蛋白质有时会导致其伴侣蛋白的激活，这种方式对细胞乃至个体都是有害的。了解蛋白质靶点及其蛋白质群落对于制造更早、更快、更安全有效的药物至关重要。

现在，蛋白质组学处于一个独特的地位，这确实是一项允许我们探索蛋白质所有方面的技术。因此，我们可以在药物研发的所有阶段使用它。无论是我们在相对早期的体外研究中试图发现新机制并识别新的先导分子，还是我们将这些分子带入细胞并试图了解它们的活性，最终试图开发出我们带入临床的更好的候选分子，以及在后期的体内和组织研究中，当我们最终试图建立临床生物标志物来告诉我们药物何时有效并被证实安全时。蛋白质组学有望提高药物研发所有三个阶段的成功率。

我在这里指出，这是我们在 Interline 内部使用 BioRender 平台制作的众多图表之一，旨在向我们新组建的团队以及监督公司并对我们所做工作感兴趣的众多利益相关者传达这一信息。

那么，这就是 Interline 的三个要素：

我们希望识别与疾病相关且与蛋白质群落有联系的基因变异。我们希望确定疾病相关变异如何改变蛋白质群落，然后我们希望发现能够纠正这些群落的药物，因为目前有两百万个已完全测序的人类基因组，我们最终希望将这些信息转化为对患者有效的疾病治疗方法。

我们建立的范式是：基因、图谱、调节剂。我们将识别基因变异，绘制它们的蛋白质群落图谱，并制造这些群落的调节剂，其理念是，在某些情况下，我们制造的这些分子（即调节剂）将成为有效的治疗药物。现在，再次强调，用文字思考这种范式是一回事，但将其转化为图片可以让我们在全新的细节层面上真正探索它。你知道，一个基因表达单个蛋白质的想法，但实际上，一个蛋白质作为更大复合物的一部分参与其中，可能与三、四个、五个、十个其他蛋白质一起，所有这些蛋白质都来自它们各自的基因，而且可能只有一个发生了突变或变异。在其他情况下，同一个复合物中的多个成员可能在同一种疾病中表现出基因变异。这种情况经常发生。

当我们想到图谱时，这是一张 Cullin E3 泛素连接酶蛋白质家族以及所有与 Cullin 支架相关的其他蛋白质的图谱。但你可以再次想象，这是一个并不存在于每个细胞中的复杂群落，它们何时以及如何改变其功能、活性和位置确实很重要。当然，还有调节剂的概念，我们将分子放入特定蛋白质上的特定位置，并期望它具有特定的活性，所有这些我们都打算通过现有的技术在生化和结构上进行解读。

这就是我们正在做的事情。我们在 Interline 建立了一个不断壮大的科学和领导团队，这是一个世界级的团队，结合了领导经验与多样化的生物分析和计算专业知识。我们正在继续壮大，本周我们的人数达到了 27 人，所以我们非常高兴能拥有一个能够真正推进科学，并最终在南旧金山共同开发针对常见疾病的新药的团队。随着团队的组建，我们花了很多时间设计正确的实验，并交流这些实验如何影响药物研发。这正是 BioRender 一次又一次为我们发挥作用的地方。所以，这是描述我们将在 Interline 进行的一项常见实验的图表之一，也是众多实验中的一个。

我们将拥有人类细胞系，并用刺激物（在本例中为免疫刺激）对它们进行处理，时间序列从几分钟到几小时不等。这些实验的复杂性确实巨大，因为我们将从所有这些样本中提取所有蛋白质，并将它们混合成一个单一的样本，但样本的所有部分都将保留。来自所有样本的所有蛋白质都将被条形码标记，在质谱仪中进行分析，最后，我们将使用我们的生物信息学和计算软件将数据拆解开来，以获得蛋白质组中数万个特征的定量条形码。事实上，即使在今天，我们也可以在蛋白质组富集的时间进程和剂量反应实验中轻松识别 8,000 种蛋白质和超过 25,000 种翻译后修饰或特征。我们的期望是，当系统地应用于理解药物研发中使用的模型系统时，它将对我们成功开发正确分子的能力产生影响。

所以，我回到我在之前幻灯片中提到的关于自噬途径和 ATG 1601 基因的工作。我的同事 Audie Murphy 对它在控制细胞内病原体（如福氏志贺氏菌）感染方面的作用很感兴趣。因此，我们进行了一项全球蛋白质实验，正如我所说，最终获得了近 40,000 条关于蛋白质组及其在野生型细胞与缺乏 ATG-1601 或缺乏自噬途径的细胞之间，以及在未感染或感染这种重要病原体一小时或三小时的细胞之间如何变化的独特定量数据。

通过这个过程，我们能够通过这些定量数据识别并发布数千种不同的蛋白质谱。同样，当你开始查看这样的数据时，可视化绝对是至关重要的。一个人无法一次性消化所有信息，能够在数据中穿梭和遨游的能力至关重要。在这里，我想特别提一下 PerkinElmer 的同事们使用典型的 Spotfire 工具所做的出色工作。因此，这些数据可在 PerkinElmer 网站分析资源中心提供的交互式 Spotfire 仪表板中查看。我在演讲底部的链接中为您指出了这一点，以便您可以看到这些交互式可视化如何补充真正精美的插图。

为了描述我们正在进行的实验，对这些多尺度疾病图谱的洞察力通过交互式可视化工具实现的交互式探索而变得栩栩如生。所以，我想在最后几分钟结束演讲，谈谈这位非常有才华的研究生、现任住院医师 Kurt Reichermeier 所做的工作。Kurt 在加州理工学院攻读博士学位期间来到我在基因泰克的实验室。他在 Ray Deshays 的实验室工作，当 Ray 去安进公司担任领导职务时，他与 Ingrid Wertz 一起加入了我的小组。Kurt 的项目是研究负责将泛素取出并将其放置到其他蛋白质上，即连接或结合这些蛋白质的蛋白质。具体来说，他对 CRR CRL4 或 Cullin 4 泛素连接酶家族感兴趣，以了解这些蛋白质的所有动态相互作用，以及这些相互作用最终如何在细胞和疾病的背景下发挥作用。

所以，Cullin 4 环连接酶是非常复杂的分子机器。它们在底部有一个红色的支架，即 Cullin，以及 rbx1，然后在橙色的顶部，它们有一个适配器蛋白，本质上就像钻头末端的钻头夹。钻头或 DCAF 是可交换的蛋白质，负责招募底物，以便这种分子机器可以作用于它们。事实上，它确实是这样做的：引入底物，对其应用泛素，然后在适当的时候释放它，以便它可以作用于下一个蛋白质。问题是，这些分子机器如何重塑自身以作用于任何时刻存在的任何蛋白质底物？

Kurt 使用了各种不同的工具来剖析该系统的所有复杂组件。在第一层，他有效地计算了人类细胞内多达 30 多种蛋白质中每种蛋白质的分子数量，然后拉下复合物，再次计算了他能够富集的复合物中存在的分子。例如，他证明了支架 Cullin 的丰度大约与 rbx1（其必然的伴侣）相当，证明了适配器蛋白 DDB1 的丰度略低，几乎等同于所有被拉下的 DCAF 的总和。然后，他能够剖析所有大约 30 种不同的 DCAF 蛋白质，并证明 Cereblon（多发性骨髓瘤中免疫调节药物的靶点，以及几十年前产生如此可怕影响的沙利度胺分子）是他所研究的细胞系中丰度最高的 DCAF 蛋白质。然后，如果你顺着……

列表中丰度低 100 倍的是一些有趣且重要的蛋白质，例如 DCAF-15。然而，即使对于一种丰度比丰度最高的 DCAF 低 100 倍的蛋白质，将一种与 DCAF-15 结合并引入其底物（蛋白质 RBM 39）的药物放入细胞中，也会非常特异性地导致 DCAF-15 招募并组装到活跃的 Cullin 4 环连接酶复合物上，从而使其能够完成工作，并最终降解或破坏 RBM 39 蛋白质。

因此，我们相信这些实验确实可以应用于一个又一个的项目，这就是我们将在 Interline 所做的事情。我们确实相信，这些将使我们的平台与众不同，或者说这些新技术将使我们的平台脱颖而出。

因此，我们将从一些人类基因测序数据开始，这些数据将指向我们想要作用的潜在治疗靶点。然后，我们将利用测序和交互式序列预测以及机器学习，真正去预测蛋白质相互作用，这些相互作用将通过实验性质谱蛋白质组学以及非质谱蛋白质组学工具进行验证。我们将获取这些数据并将其转化为扩展的分子动力学模拟，以了解蛋白质关系，然后进行 Giga 对接和结合亲和力预测，以便我们可以优化作用于这些蛋白质的分子。现在，其中许多将是应用程序，所有这些都将是我们流程中绝对必要的组成部分，但我们相信关键的差异化因素将是前两个：结合主动学习的序列到相互作用预测，以及将应用于每一个项目的质谱蛋白质组学。

这正是我们关注的重点：将这一技术平台应用于一个又一个项目，并将其置于炎症性疾病和肿瘤学领域中。目前已确定了许多疾病的遗传驱动因素，蛋白质群落也开始被阐明，我们正在此处验证其中的许多内容。归根结底，医疗需求仍有巨大缺口，而随着我们开始探索蛋白质群落并理解其运作方式，精准医疗将迎来广阔的发展机遇。

说到这里，我想停下来感谢几位朋友。首先是我们在 Interline 不断壮大的团队，特别是 Zach Sweeney，是他让我相信现在正是投身于此的绝佳时机，并促使我下定决心与在座的各位共同创立这家公司。还要感谢我在 Genentech 共事了 13 年多的优秀团队，我们曾一起从事科学研究并探索药物发现。最后，我想特别提一下，今天是母亲 70 岁生日。父母很少有机会看到孩子进行科学演讲，但今天她即使在夏威夷度假，也特意加入了观众席。所以，我想对妈妈说声生日快乐，我爱你。谢谢大家。