Communiquer sur les communautés protéiques

Présentation

Nous avons l'honneur d'accueillir le Dr Don Kirkpatrick en tant que premier conférencier invité. Il a été l'un des tout premiers ambassadeurs de BioRender et avait même invité Shiz et Ryan, deux de nos trois cofondateurs, dans la région de la baie de San Francisco pour animer des ateliers chez Genentech, où il travaillait à l'époque. Il a cru en BioRender dès ses débuts et nous a fourni énormément de retours précieux pour améliorer notre plateforme il y a des années, et nous l'en remercions vivement. Pour situer son parcours, le Dr Kirkpatrick étudie les protéines, et plus particulièrement l'ubiquitine, depuis plus de 20 ans. Son parcours universitaire en biochimie et en pharmacologie l'a conduit à un poste de chercheur postdoctoral à la Harvard Medical School. Par la suite, il a mis son expérience au service de Genentech pour développer des technologies de protéomique par spectrométrie de masse dédiées à la découverte de médicaments. Actuellement vice-président et directeur technique chez Interline Therapeutics, il est aujourd'hui parmi nous pour parler des communautés protéiques et partager sa vision sur la manière de communiquer l'importance de ces recherches à des personnes de tous horizons scientifiques. Je vous invite donc à réserver un accueil chaleureux au Dr Don Kirkpatrick.

Merci beaucoup pour cette merveilleuse présentation. C'est un réel plaisir d'être ici pour vous raconter l'histoire d'Interline Therapeutics et, surtout, celle des communautés protéiques. Je suis également très heureux d'être parmi l'équipe de BioRender. C'est un plaisir de les voir évoluer depuis le travail initial de Ryan, Shiz et toute l'équipe, qui ont su créer des outils aidant les scientifiques à mieux communiquer leurs découvertes.

L'histoire que je souhaite vous raconter aujourd'hui commence avec la cellule humaine moyenne, que voici en micrographie électronique à balayage.

Dans un macrophage humain, la cellule moyenne contient 10 milliards de molécules protéiques, ce qui équivaut presque au nombre total d'êtres humains sur Terre. Il est intéressant de noter la concentration de protéines au sein d'une cellule, qui est extrêmement élevée, proche de 100 mg/ml. Pour prendre une analogie, ce serait comme zoomer sur la Terre et observer un stade bondé où tous les individus se bousculent, avec des familles, des groupes, des collègues de travail, et ainsi de suite.

Mais, comme nous le savons, tout comme dans les communautés humaines, des forces environnementales — telles qu'une infection — peuvent modifier radicalement le comportement, les actions, les fonctions et les lieux d'agrégation de ces communautés. C'est exactement ce qui se passe avec les protéines.

Comme je l'ai dit, la cellule humaine moyenne contient 10 milliards de protéines à une concentration très élevée, presque comme du sirop de pancake. La plupart des protéines fonctionnent au sein de communautés protéiques complexes ; elles entretiennent de nombreuses relations dont je vous parlerai dans un instant. Pourtant, historiquement, la découverte de médicaments s'est concentrée sur des protéines isolées, lors d'expériences menées à des concentrations de l'ordre de 1 mg/ml — contre près de 100 mg/ml dans la cellule — et en utilisant, dans l'ensemble, des mesures simplistes à point final unique pour comprendre les fonctions de processus par ailleurs très complexes. L'un des principes fondamentaux chez Interline est que nous pouvons améliorer le succès de la découverte de médicaments en comprenant ces communautés protéiques, et c'est ce dont je souhaite vous parler aujourd'hui.

Pour revenir à mon parcours et à la façon dont j'en suis venu à m'intéresser à l'intersection entre communautés protéiques et découverte de médicaments, j'ai commencé par une licence en biochimie à l'Université de l'Oklahoma. Je dirais que, comme pour beaucoup d'entre nous, nos carrières scientifiques sont façonnées par les mentors que nous rencontrons tôt dans notre parcours. Le premier pour moi fut le Dr Pete Smith, rencontré lors d'un congrès de la Society of Toxicology, qui m'a permis d'obtenir mon tout premier stage et m'a encouragé à explorer la science et la découverte de médicaments, me montrant qu'il y avait des découvertes importantes et passionnantes à faire. Il avait étudié à l'Université de l'Oklahoma et m'a encouragé à rejoindre le département de pharmacologie, où j'ai rencontré mon second mentor scientifique, le professeur Jay Gandolfi. Jay m'a donné la liberté de commencer à explorer et à comprendre les protéines. C'est là que j'ai découvert cette protéine sur laquelle je travaille depuis 20 ans. Je dirais même que c'est la protéine la plus importante de toutes les cellules humaines : l'ubiquitine.

Nous avons commencé très tôt à utiliser une nouvelle technologie pour étudier les protéines : le spectromètre de masse. C'est ce travail qui m'a conduit à un stage postdoctoral dans le laboratoire de Steve Gygi à la Harvard Medical School. Ce choix était largement motivé par cet article publié par un ami et collègue de longue date, Jin Min Pang, qui était à l'époque postdoctorant dans le laboratoire de Steve. Ils avaient identifié 1 072 protéines modifiées par l'ubiquitine, alors que ma propre thèse de doctorat n'en comptait que 23. Lorsque vous voyez une avancée technologique qui dépasse tout ce que vous pouviez imaginer, vous comprenez à quel point il était crucial pour moi d'aller apprendre ces nouvelles technologies et de voir comment elles pouvaient être utilisées pour explorer la biologie qui nous passionnait.

C'est ce que j'ai fait dans le laboratoire de Steve, en me concentrant sur l'ubiquitine et les communautés protéiques qu'elle contrôle. À l'époque, nous ne réalisions pas vraiment qu'il s'agissait de communautés à part entière. L'ubiquitination des protéines impliquées dans le cycle cellulaire, comme la cycline D, ou des cibles thérapeutiques importantes comme le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), m'a conduit chez Genentech. J'y ai passé de nombreuses années à essayer d'élucider les communautés protéiques liées aux maladies humaines et à la découverte de médicaments. J'ai travaillé avec une équipe formidable au sein du groupe de protéomique de découverte, développant sans cesse des technologies pour comprendre les cellules humaines, les processus qui dysfonctionnent dans les maladies et les moyens d'intervenir médicalement pour aider les patients.

L'un des premiers projets sur lesquels nous avons travaillé était la protéine LRRK2, une kinase associée à la maladie de Parkinson. En plus de nous apprendre des choses fascinantes sur la façon dont les variants associés à la maladie altèrent la fonction extracellulaire, ce projet m'a mis en contact avec Zack Sweeney, que je vous présenterai dans un instant et qui occupe aujourd'hui le poste de PDG chez Interline Therapeutics. Plus récemment, nous avons utilisé la spectrométrie de masse pour étudier des protéines mutantes, en particulier des protéines oncogéniques responsables de cancers. Nous avons pu démontrer, grâce au spectromètre de masse, que ces protéines mutantes pouvaient être sélectivement dégradées par des médicaments, ce qui a un impact profond sur la viabilité des cellules cancéreuses.

L'ubiquitine est une protéine essentielle qui contrôle un grand nombre de processus cellulaires. L'un des endroits où elle joue un rôle clé est la mitochondrie, la centrale énergétique de la cellule. Celle-ci contient environ un millier de protéines, et toutes, sauf 13, doivent être importées à travers la membrane mitochondriale ; l'ubiquitine y joue là encore un rôle crucial. La spectrométrie de masse nous a aidés à comprendre bon nombre des protéines clés impliquées dans ce processus.

Il existe un processus ou une voie similaire à l'ubiquitine, appelé autophagie, qui se déroule dans de nombreuses cellules. L'une de ses fonctions est d'aider les cellules à gérer les infections par des agents pathogènes. Nous voulions comprendre comment la voie de l'autophagie et la signalisation immunitaire innée interagissaient dans ce contexte.

Je mentionne cet article pour deux raisons : c'est le premier pour lequel j'ai réalisé une figure avec BioRender, que nous avons fini par publier, et c'est aussi un exemple où la technologie a démontré l'immensité de l'espace protéomique et notre capacité à comprendre le fonctionnement de ces protéines avec une grande précision.

Je vais en parler davantage dans quelques minutes. Enfin, je mentionnerai les travaux technologiques réalisés pour commencer à explorer les communautés protéiques dynamiques, un sujet sur lequel je reviendrai également. Ces travaux ont attiré l'attention de plusieurs personnes, dont Zach Sweeney, Nick Galley, On Saha et le groupe qui s'est réuni ici chez Interline Therapeutics, avec l'idée que les communautés protéiques pourraient être au cœur de la découverte de médicaments. Nous avons mis en place des technologies pour explorer ces communautés et comprendre leur fonction, afin de développer des médicaments de manière plus efficace, plus rapide et plus fructueuse.

Parlons un peu plus des communautés protéiques. Que sont-elles, que signifient-elles et comment la protéomique nous aide-t-elle dans ce contexte ? Commençons par le protéome. Le protéome est la composition complète de toutes les protéines existant au sein des cellules et des tissus. Si vous revenez à ce macrophage humain ou à n'importe quelle autre cellule, environ 10 000 à 11 000 gènes expriment 10 000 à 11 000 protéines différentes. Certaines sont présentes à un million d'exemplaires ou plus par cellule, d'autres à seulement 1, 10 ou 100 exemplaires, totalisant ces 10 milliards de molécules protéiques. Le protéome d'une cellule humaine reflète une variété d'entrées : le génotype de la cellule, son type (est-ce un cardiomyocyte, un hépatocyte du foie, une cellule immunitaire comme un macrophage ?), l'environnement dans lequel elle réside (y a-t-il une inflammation, une lésion tissulaire ?), et bien sûr, son état de perturbation (a-t-elle été exposée à des médicaments ou à d'autres produits chimiques toxiques ?). Le protéome se remodèle dans tous ces contextes.

Voilà pour le protéome, et la protéomique est en quelque sorte le prisme à travers lequel nous essayons de le comprendre. Les spectromètres de masse et la spectrométrie de masse sont parmi les nombreux outils qui nous permettent d'appréhender les protéines, leurs fonctions et leurs activités. Nous avons commencé à les considérer comme des communautés protéiques, c'est-à-dire des relations entre groupes de protéines, des dimensions ou des tranches du protéome qui permettent de comprendre ce qui se passe.

Parmi les communautés protéiques, nous distinguons les communautés physiques, où les protéines entrent physiquement en contact les unes avec les autres. Imaginez les membres d'une famille, par exemple. Les communautés protéiques fonctionnelles sont celles qui agissent dans un processus unique. Vous pourriez imaginer les personnes avec qui vous travaillez au quotidien. Il existe des communautés protéiques spatiales : elles ne sont pas liées physiquement ou fonctionnellement, mais elles résident au même endroit, comme des personnes habitant le même immeuble. Enfin, il y a les communautés co-régulées, un concept un peu plus abstrait, que l'on pourrait comparer à des personnes partageant la même affiliation politique ou religieuse, dont les actions sont dictées par un processus d'ordre supérieur.

Voici comment nous percevons le protéome et les communautés protéiques. L'un des principes fondamentaux d'Interline Therapeutics est que les approches actuelles ne nous permettent pas de comprendre suffisamment bien les mécanismes moléculaires à l'œuvre au sein de ces communautés. Il existe un large éventail

Différentes technologies sont utilisées dans la découverte de médicaments, telles que l'imagerie, la caractérisation de l'ARNm par séquençage ARN et celle des métabolites par la métabolomique. Cependant, la grande majorité des cibles thérapeutiques sont des protéines. En nous concentrant sur ce niveau et en appréhendant non pas une seule protéine, mais des communautés complexes de protéines dans toutes leurs interactions — physiques, fonctionnelles et spatiales — nous avons de meilleures chances de comprendre le processus pathologique et le mode d'action de nos médicaments. Nous sommes convaincus que la protéomique est en mesure de définir les mécanismes moléculaires des cibles thérapeutiques génétiquement validées.

Cette diapositive illustre le rôle important que jouent les complexes protéiques, ou communautés protéiques plus larges, dans le succès ou l'échec d'une molécule. Il existe des cibles associées à des variantes génétiques, les complexes auxquels elles participent, ainsi que les modulateurs de ces protéines individuelles dans les domaines pathologiques concernés. L'idée est qu'en plaçant la protéomique au cœur de la découverte de médicaments, nous pouvons passer de la boîte bleu clair à la boîte bleu foncé et exploiter davantage de cibles thérapeutiques sur lesquelles nous pouvons agir.

Nous pensons que les meilleurs médicaments de leur catégorie se définissent par leur impact sur les interactions protéiques. C'est de plus en plus le cas pour divers programmes de découverte de médicaments, couronnés de succès ou non, dans les secteurs de la biotechnologie et de la pharmacie. La majeure partie du travail consiste à tenter d'inhiber les enzymes ou les sites catalytiques des protéines, ce qui a globalement fonctionné pour les médicaments ayant réussi. Mais lorsque ce n'est pas le cas, plusieurs raisons l'expliquent. Par exemple, les processus pilotés non pas par la catalyse, l'activité ou la fonction d'une enzyme, mais plutôt par l'interaction entre deux protéines, sont souvent négligés. Il existe également des cas rares, comme celui de Wrath, un oncogène ou protéine important dans le cancer, où l'inhibition de cette protéine peut parfois entraîner l'activation de ses protéines partenaires d'une manière délétère pour la cellule et, in fine, pour l'individu. Comprendre la cible protéique et ses communautés est essentiel pour concevoir des médicaments plus efficaces, plus rapides et plus sûrs.

La protéomique occupe une position unique ; c'est une technologie qui nous permet d'explorer tous les aspects des protéines. Nous pouvons donc l'utiliser à tous les stades de la découverte de médicaments. Qu'il s'agisse d'études in vitro relativement précoces pour découvrir de nouveaux mécanismes et identifier de nouvelles molécules chefs de file, d'introduire ces molécules dans des cellules pour comprendre leurs activités, de développer de meilleurs candidats pour les essais cliniques, ou enfin, lors des étapes ultérieures, d'études in vivo et tissulaires pour établir des biomarqueurs cliniques confirmant l'efficacité et la sécurité du médicament. La protéomique est prête à améliorer le succès des trois phases de la découverte de médicaments.

Je précise ici qu'il s'agit de l'une des nombreuses figures que nous créons chez Interline à l'aide de la plateforme BioRender, afin de communiquer ces informations à notre nouvelle équipe en cours de constitution, ainsi qu'aux nombreuses parties prenantes qui supervisent l'entreprise et s'intéressent à nos travaux.

Voici les trois piliers d'Interline :

Nous voulons identifier les variantes génétiques associées aux maladies et ayant un lien avec les communautés protéiques. Nous voulons déterminer comment ces variantes modifient ces communautés, puis découvrir des médicaments capables de les corriger. Il existe deux millions de génomes humains entièrement séquencés, et notre objectif ultime est de traduire ces informations en traitements efficaces pour les patients.

Le paradigme que nous avons établi est : gènes, cartes, modulateurs. Nous allons identifier les variantes génétiques, cartographier leurs communautés protéiques et créer des modulateurs de ces communautés, avec l'idée que, dans certains cas, ces molécules deviendront des médicaments thérapeutiques efficaces. Penser à ce paradigme est une chose, mais le visualiser nous permet de l'explorer avec un niveau de détail inédit. Un gène exprime une protéine, mais celle-ci participe en réalité à un complexe plus vaste, composé peut-être de trois, quatre, cinq ou dix autres protéines issues de leurs gènes respectifs, dont une seule est peut-être mutée ou variante. Dans d'autres cas, plusieurs membres du complexe peuvent présenter des variantes génétiques pour une même maladie. Cela arrive souvent.

En ce qui concerne les cartes, voici celle de la famille des protéines ligases ubiquitine Cullin E3 et de toutes les autres protéines associées aux échafaudages Cullin. Il faut imaginer qu'il s'agit d'une communauté complexe qui n'existe pas dans toutes les cellules, et le moment et la manière dont elles modifient leur fonction, leur activité et leur localisation sont cruciaux. Vient ensuite l'idée des modulateurs : nous introduisons une molécule à un endroit précis sur une protéine spécifique, en attendant une activité distincte, le tout étant analysé biochimiquement et structurellement grâce aux technologies en place.

C'est ce que nous faisons. Nous avons constitué une équipe scientifique et de direction grandissante ici chez Interline, un groupe de classe mondiale alliant expérience de gestion et expertises biologique, analytique et computationnelle diversifiées. Nous continuons de croître ; nous avons atteint 27 personnes cette semaine. Nous sommes ravis d'avoir une équipe capable de faire progresser la science et le développement de nouveaux médicaments pour des maladies courantes, ici même à South San Francisco. Alors que cette équipe se soude, nous consacrons beaucoup de temps à concevoir les bonnes expériences et à communiquer sur leur impact dans la découverte de médicaments. C'est là que BioRender intervient constamment pour nous. Voici l'une des figures décrivant une expérience courante que nous menons chez Interline, parmi tant d'autres.

Nous utilisons des lignées cellulaires humaines que nous traitons avec des stimuli, dans ce cas un stimulus immunitaire, sur une série temporelle allant de quelques minutes à plusieurs heures. La complexité de ces expériences est immense, car nous prélevons toutes les protéines de ces échantillons pour les mélanger en un seul échantillon. Toutes les protéines seront ensuite marquées par code-barres, analysées par spectrométrie de masse, puis nous utiliserons nos logiciels de bio-informatique et de calcul pour dissocier ces données et obtenir des codes-barres quantitatifs pour des dizaines de milliers de caractéristiques du protéome. En fait, nous pouvons identifier facilement 8 000 protéines et plus de 25 000 modifications post-traductionnelles ou caractéristiques au sein du protéome, même aujourd'hui, dans le cadre d'expériences enrichies de séries temporelles et de réponses à la dose. Nous espérons qu'en appliquant cela systématiquement pour comprendre les modèles utilisés dans la découverte de médicaments, nous améliorerons notre capacité à réussir et à développer les bonnes molécules.

Je reviens au travail mentionné dans une diapositive précédente concernant la voie de l'autophagie et le gène ATG16L1. Mon collègue Audie Murphy s'y intéressait depuis longtemps pour son rôle dans le contrôle de l'infection par des pathogènes intracellulaires tels que Shigella flexneri. Nous avons donc réalisé une expérience protéique globale, comme je l'ai décrit, et avons obtenu près de 40 000 données quantitatives distinctes sur le protéome et ses changements entre des cellules de type sauvage et des cellules dépourvues d'ATG16L1 ou de la voie de l'autophagie, ainsi qu'entre des cellules non infectées et infectées pendant une ou trois heures par cet important pathogène.

Grâce à ce processus, nous avons pu identifier et publier des milliers de profils protéiques différents à partir de ces données quantitatives. Encore une fois, lorsque l'on examine de telles données, la visualisation est absolument critique. Il est impossible de assimiler toutes les informations en un seul passage, et la capacité de naviguer et de plonger dans les données est essentielle. Je tiens à souligner l'excellent travail réalisé par les équipes de PerkinElmer avec l'outil Spotfire. Ces données sont disponibles dans des tableaux de bord interactifs Spotfire sur le site Web de PerkinElmer, dans leur centre de ressources analytiques. Je vous renvoie au lien en bas de la présentation pour voir comment ces visualisations interactives complètent les magnifiques illustrations que l'on peut réaliser.

Pour décrire nos expériences, les perspectives offertes par ces cartes de maladies multi-échelles prennent vie grâce à l'exploration interactive rendue possible par des outils de visualisation. Je souhaite conclure cette présentation en évoquant le travail réalisé par un étudiant diplômé très talentueux, aujourd'hui interne en médecine, Kurt Reichermeier. Kurt a rejoint mon laboratoire chez Genentech au milieu de son doctorat à Caltech. Il était dans le laboratoire de Ray Deshaies et a rejoint mon groupe avec Ingrid Wertz lorsque Ray a pris ses fonctions de direction chez Amgen. Le projet de Kurt consistait à étudier les protéines responsables du transfert de l'ubiquitine sur d'autres protéines, en les attachant ou en les conjuguant. Il s'intéressait plus particulièrement à la famille des ligases ubiquitine CRL4 pour comprendre toutes les interactions dynamiques de ces protéines et leur rôle dans les cellules et, in fine, dans les maladies.

Les ligases CRL4 sont des machines moléculaires très complexes. Elles possèdent un échafaudage en bas, en rouge, la Cullin, ainsi que la RBX1. En haut, en orange, se trouve une protéine adaptatrice qui agit essentiellement comme le mandrin d'une perceuse. Les embouts, ou DCAF, sont des protéines échangeables responsables du recrutement des substrats afin que cette machine moléculaire puisse agir sur eux. C'est précisément ce qu'elle fait : attirer un substrat, y appliquer l'ubiquitine, puis, au moment opportun, le libérer pour agir sur la protéine suivante. La question est de savoir comment ces machines moléculaires se remodèlent pour agir sur les substrats protéiques présents à tout moment.

Kurt a utilisé divers outils pour disséquer tous les composants complexes de ce système. Dans un premier temps, il a compté le nombre de molécules de chacune des protéines — jusqu'à plus de 30 protéines différentes dans les cellules humaines — puis a isolé les complexes et compté les molécules présentes dans ceux qu'il avait pu enrichir. Il a montré, par exemple, que l'échafaudage Cullin était à peu près aussi abondant que la RBX1, son partenaire obligatoire, démontrant que la protéine adaptatrice DDB1 était présente en abondance légèrement inférieure, presque équivalente à la somme de tous les DCAF isolés. Il a ensuite pu disséquer toutes les différentes protéines DCAF, au nombre d'environ 30, et démontrer que la céréblon, cible des molécules IMiD dans le myélome multiple, ainsi que la molécule thalidomide — qui a eu des effets si terribles il y a plusieurs décennies — était la plus abondante des protéines DCAF dans les lignées cellulaires qu'il étudiait. Puis, en descendant la liste...

...il a constaté qu'à une abondance 100 fois moindre se trouvaient des protéines intéressantes et importantes telles que DCAF15. Pourtant, même pour une protéine 100 fois moins abondante que le plus courant des DCAF, l'introduction d'un médicament dans les cellules qui engage DCAF15 et attire son substrat, la protéine RBM39, conduit très spécifiquement au recrutement et à l'assemblage de DCAF15 sur un complexe actif de ligase CRL4, afin qu'il puisse accomplir sa tâche et, finalement, dégrader ou détruire la protéine RBM39.

C'est ce type d'expériences que nous pensons pouvoir appliquer projet après projet, et c'est ce que nous ferons ici chez Interline. Nous sommes convaincus que ces nouvelles technologies différencieront notre plateforme.

Nous commencerons par des données de séquençage génétique humain qui nous orienteront vers les cibles thérapeutiques probables sur lesquelles nous souhaitons agir. Nous tirerons ensuite parti de la prédiction des interactions séquencées et de l'apprentissage automatique pour prédire les interactions protéiques, qui seront ensuite validées par la protéomique expérimentale par spectrométrie de masse ainsi que par des outils de protéomique sans spectrométrie de masse. Nous intégrerons ces données dans des simulations de dynamique moléculaire étendue pour comprendre les relations protéiques, puis nous utiliserons le Giga-docking et la prédiction d'affinité de liaison pour affiner et optimiser les molécules qui agiront sur ces cibles. Beaucoup de ces éléments seront essentiels à notre pipeline, mais nous pensons que les principaux facteurs de différenciation seront ces deux premiers points : la prédiction des interactions par séquençage avec apprentissage actif, ainsi que la protéomique par spectrométrie de masse qui sera appliquée à chaque projet.

C'est précisément sur ce point que nous nous concentrons : déployer cette plateforme technologique projet après projet, tant dans le domaine des maladies inflammatoires qu'en oncologie. De nombreux facteurs génétiques responsables de maladies ont été identifiés et les communautés protéiques commencent à être élucidées. Nous en validons un grand nombre ici, car il existe un besoin médical majeur non satisfait et une réelle opportunité pour la médecine de précision, qui se concrétisera à mesure que nous explorerons ces communautés protéiques et que nous en comprendrons le fonctionnement.

Je souhaite m'arrêter ici pour remercier plusieurs personnes : notre équipe grandissante chez Interline, et tout particulièrement Zach Sweeney, qui m'a convaincu que le moment était venu de franchir le pas et de bâtir cette entreprise avec le groupe présent ici. Je remercie également la formidable équipe de Genentech, avec qui j'ai travaillé pendant plus de 13 ans à faire de la science et à explorer la découverte de médicaments. Enfin, une mention spéciale : c'est aujourd'hui le 70e anniversaire de ma mère. Il est rare que les parents puissent assister aux présentations scientifiques de leurs enfants, mais elle a tenu à être présente dans le public aujourd'hui, même en vacances à Hawaï. Alors, joyeux anniversaire maman, je t'aime. Merci à tous.